• 转录早于翻译：比如药物刺激后，mRNA 可能 6 小时就冲顶，但蛋白合成要等到 24 小时后（如：IL-6 mRNA 快速升高，蛋白却因分泌 / 降解难检测）。

• 蛋白“超常待机”：结构蛋白（如 β-actin）半衰期长达数天，就算 mRNA 早降解了，WB 还能抓到 “残留选手”。

破解指南：做时间梯度实验！比如分别在 0、6、12、24 小时取样，看 mRNA 和蛋白的动态曲线是否错位。

• RNA怕RNase污染（手套没戴对，枪头没灭菌都可能让qPCR数据假阴性）；

• 蛋白怕变性（提取膜蛋白不用强去垢剂，分分钟聚集成团让WB显影失败）。

引物&抗体：特异性才是“王道”

• qPCR引物跨外显子设计失败？直接漏检mRNA；

• WB抗体认“亲戚”（比如交叉识别同源蛋白），跑出非特异条带坑哭你。

破解指南：引物做标准曲线（斜率-3.1～-3.6才合格）；抗体用敲除细胞验证特异性。

• 用β-actin 做 WB 内参，结果细胞骨架被处理后，内参自己先 “叛变”（表达量乱飘）；

• qPCR选GAPDH当内参，却不知道它在缺氧条件下会表达不稳定。

蛋白质的“生死时速”：降解比合成快｜蛋白降解的“三大杀手”

• 泛素-蛋白酶体系统：p53这类短寿命蛋白，即使mRNA水平高，WB也难以检测；

• 溶酶体自噬：膜蛋白错误折叠？直接被自噬小体吞掉；

• 翻译后修饰：磷酸化可能给蛋白贴“降解标签”，WB根本抓不住活口。

破解指南：加蛋白酶抑制剂！提蛋白时别忘了PMSF、蛋白酶抑制剂cocktail，延缓降解。

翻译调控：mRNA多≠蛋白多｜翻译的“千层套路”

• miRNA蹲点狙击：比如肿瘤细胞中，致癌基因mRNA被miRNA结合，翻译直接“卡壳”；

• 应激模式开启：缺氧时细胞磷酸化eIF2α，全局翻译暂停，mRNA再多也白塔。

破解指南：做荧光素酶报告基因试验，看3‘UTR是否被miRNA靶向。

翻译后修饰：蛋白“变装”躲掉WB｜蛋白的“障眼法”

• 分泌蛋白（如细胞因子）刚合成完就“跑路”到胞外，WB在胞内找不到；

• 磷酸化/糖基化改变抗体识别表位，比如总ERK和p-ERK的WB结果可能天差地别。

破解指南：用亚细胞组分分离试剂盒！想测分泌蛋白，直接收培养基做WB。