君跻生物CRISPR-Screen-NGS指南：从海量基因到关键靶点

发布时间：2026-09-14

为什么CRISPR Screen实验前要先做文库质检？

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sgRNA文库是CRISPR筛选的“武器库”，其质量直接决定实验成败。文库质检的核心是验证两个关键指标：覆盖度（sgRNA是否覆盖了所有目标基因）和均一性（各sgRNA的丰度是否均衡）。

通过NGS对原始质粒文库进行深度测序，可以评估是否存在偏好在扩增过程中被过度富集或丢失的sgRNA序列。如果文库均一性差（即部分sgRNA占比过高，另一些几乎检测不到），那么在筛选前就已经存在“偏科”，后续的富集分析将失去可靠性。

简言之，不做文库质检的CRISPR Screen，结果只能是漏洞百出。

筛选后的NGS测序，深度要达到多少才够？

测序深度是CRISPR Screen数据质量的另一个决定因素。一般建议每个样本的测序深度至少达到文库规模的300倍以上。

例如，一个靶向20000个基因、每个基因设计6条sgRNA的文库（总计12万条sgRNA），每个样本的测序数据量应保证每条sgRNA平均被读到300次以上，即总reads数不低于3600万条。

如果测序深度不足，低丰度的sgRNA可能因随机取样而丢失，导致假阴性；但深度并非越高越好，过高的深度会带来不必要的成本。理想的测序深度应在保证数据饱和的前提下，兼顾成本效益——通常以sgRNA丰度分布曲线趋于平缓为判断标准。

正筛选和负筛选在数据分析上有什么区别？

正筛选：细胞在筛选压力下存活并富集。例如在药物处理组中，携带特定sgRNA的细胞因获得耐药性而扩增，对应的sgRNA丰度上升。分析时关注的是显著富集的sgRNA或基因，常用RRA评分（评分越低、排名越靠前，表示该基因越可能是靶基因）。

两种筛选的数据分析策略不同：正筛选要关注“谁涨了”，负筛选要关注“谁跌了”。在实验设计阶段就要明确筛选方向，以便后续选择合适的统计模型。

双质粒系统和单质粒系统在NGS分析时有区别吗？

双质粒系统：将sgRNA和Cas9分别装载在两个不同的质粒上，先后转导细胞（先导入Cas9稳转株，再导入sgRNA文库）；常用lentiGuide-Puro载体；

两者的NGS分析逻辑是相同的：都是通过PCR扩增sgRNA区域，深度测序，比较筛选前后各sgRNA的丰度变化。

区别在于实验设计和操作：双质粒系统需要先筛选Cas9稳转株，周期更长但灵活性更高；单质粒系统操作更简便、整合更稳定。

我们在提供NGS服务时，借助质粒图谱以设计合适的PCR引物和确定sgRNA骨架序列。无论哪种系统，只要提供完整的载体信息，分析流程都是标准化的。

君跻生物提供一站式gRNA文库服务

君跻生物搭建了集自动化和智能化为一体的基因服务技术平台，在基因合成、寡核苷酸合成、高通量测序和基因编辑服务之间嵌入一体化链路，为CRISPR sgRNA文库构建与筛选提供真正标准化、高精准、高性价比的一站式解决方案。

君跻生物依托自研的寡核苷酸合成平台，使寡核苷酸合成领域实现了 1‰的终极突变率——这意味着对于关键序列长度，君跻生物能够确保超过90.5%的sgRNA序列与理论设计完美匹配，从序列的源头确保每条gRNA都能精准打击！

覆盖度（coverage）和均一性（homogeneity）是评价文库质量的 “黄金双核” 。君跻生物在严格的质控体系下，能够向客户交付超过99%的文库覆盖度，同时保持均一性小于10的行业领先水平。

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文库构建完成后，并不是打包发货即可。君跻生物对每个交付的质粒文库都严格按照NGS测序深度≥300×的标准进行独立验证，交付高纯度无内毒素质粒（总量≥200μg），让您无需额外费力就能在实验上手的“第一公里”就拥有了足够把控质量的主动权。

基础科研或药物研发方向多种多样。对于全基因组范围的探索，君跻生物能够直接提供标准化的人和小鼠全基因组敲除文库，助力大规模的基因筛查工作。而针对精准靶向特定信号通路或靶基因集的专一需求，君跻生物的定制化服务也随时待命，根据每个客户的独有靶标进行量身设计、合成。

依托强大的NGS生物分析能力和长期的基因编辑经验，君跻生物不仅仅局限在文库质粒构建——从慢病毒包装、细胞感染、筛选压力施加，直至最终的高通量测序和数据分析，君跻生物都能够科学合理地融合代际，帮助研究人员缩短项目周期、快速锁定“命中靶点”，实现完整的验证闭环。